European journal of immunology · 2025
BTK-ингибирование усиливается TLR-7-Mediated Производство Интерферона-Альфа в РДЦ путем блокировки Ингибитории BDCA-2 Путь.
СтатьяНазвание и аннотация: Машинный перевод · не проверен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Ceglarek Laura, Gerhards Ramona, Boldrini Vinicius, Wichmann Christian, Peters Anneli, Meinl Edgar
Аннотация
В PDC производство BTK-inhibition (BTKi) блокирует производство IFN-α через TLR-9, но не через TLR-7. Включено TLR-7 Стимулирование, BTKi увеличивает производство IFN-α, блокируя ингибиторию BDCA-2 Путь. Это может частично объяснить неудачу BTKi в SLE и представляет интерес для испытаний BTKi при множественном склерозе.
Оригинал публикации
BTK-Inhibition Enhances TLR-7-Mediated Interferon-Alpha Production in pDCs by Blocking the Inhibitory BDCA-2 Pathway.
In pDCs, BTK-inhibition (BTKi) blocks the IFN-α production via TLR-9, but not via TLR-7. Upon TLR-7 stimulation, BTKi enhances the production of IFN-α by blocking the inhibitory BDCA-2 pathway. This might explain partially the failure of BTKi in SLE and is of interest for BTKi trials in multiple sclerosis.
Читать полный текст на русском ↓
Полный текст на русском
Машинный перевод · не проверен
Сокращения
Брутона киназа тирозина
Ингибиторы Брутона киназы тирозина
интерферон
многочисленная склероз
плазмацидные дендрические клетки
системный лупус эритематозус
Toll-подобный рецептор
Примечания и наблюдения
Брутона киназа тирозина (BTK) является важной частью комплекса сигналов рецептора B-клеток (BCR) и участвует в сигнализации Fc и Toll-подобных рецепторов (TLR) [1]. Хотя роль BTK в активации иммунных клеток хорошо изучена, ее функция в ингибирующих путях остается неясной. Ингибиторы BTK (BTKi) исследуются в различных аутоиммунных заболеваниях с разными результатами. В системной красной волчанке (СКВ) ингибиторы BTK (BTKi) неожиданно не показали эффективность [2], в то время как BTKi перспективны при множественном склерозе (МС) [3]. Эти различия в результатах могут в значительной мере быть обусловлены различными иммунологическими механизмами патогенеза, связанными с различными функциями интерферонов типа 1. Хотя IFN-β является утвержденным лечением при обострениях МС и сигнализация рецептора интерферонов-альфа/бета (IFNAR) на моэлоидных клетках ограничивает аутоиммунные реакции в ЦНС [4], IFN-α способствует патогенезу в СКВ. После активации через TLR-7 и TLR-9 пDCs становятся основными производителями IFN-α и, следовательно, вносят вклад в аутоиммунную инфляцию [5].В данном исследовании мы проанализировали влияние BTKi (Fenebrutinib и Ibrutinib) на производство IFN‐α пDCs через TLR‐7 или TLR‐9, а также на ингибирующий путь BDCA‐2. Связывание и последующая внутренизация BDCA‐2, C‐тип лектина, исключительно выраженного на человеческих пDCs, ингибирует производство интерферона [ 6 ]; однако точное составление сигма-комплекса, медиающего этот процесс, не полностью изучено. Мы наблюдали, что пDCs женщин производили большее количество IFN‐α при лигации TLR‐7 (Рисунок 1A). Это может быть связано с эффектами тестостерона или неполной деактивацией X-связанного гена TLR‐7 [ 7 ]. Активация pDCs через TLR‐9 (используя CpG) и TLR‐7 (используя R848) привела к высвобождению IFN‐α2 (Рисунок 1B; Рисунок S1), отражающему общее производство IFN‐α (Рисунок 1C; Рисунок S1A–C и ссылки). BTKi снизила высвобождение IF:α2 после стимуляции через TLR‐9, но не влияла на стимуляцию через TLR‐7 (Рисунок 1C–E). Какой киназа может заменить BTK в пути TLR7 в pDCs остается неизвестным. В отличие от наблюдаемых эффектов на pDCs, BTKi блокировал активацию B-клеток как через TLR‐7, так и через TLR‐9 (Рисунок S2A–D), что согласуется с предыдущими отчетами [8]. Кроме того, BTKi подавляло дифференцировку плазмабластов, обусловленную TLR, но не влияло на уже дифференцированные плазмабласты (Рис. S2E,F).
BTKi снижает активацию человека pDCs, обусловленную TLR-9, но не TLR-7. (A) Ответ на интерферон у enrichенных pDCs и частота pDCs в зависимости от пола (мужской n = 22; женский n = 13). Индекс ответа на интерферон определялся как описано в дополнении и проверялся с помощью двуххвостового t-теста. (B) Purified pDCs (n = 10) были стимулированы агентами TLR и определена величина высвобождения IFN-α2. (C) Purified pDCs (n = 12) были обработаны Ибрутинибом (черный) или Фенебрутибибом (пурпурный) в течение 1 ч перед стимуляцией CpG-A (2,5 мкг/мл). Значения IC 50 определялись с помощью логистической регрессии с использованием четырёхпараметрической лог-логистической модели. (D, E) pDCs (n = 17) были обработаны BTKi в течение 1 ч до стимуляции (D) CpG-A (2,5 мкг/мл) и (E) R848 (10 мкг/мл). Данные представляют собой среднее значение ± SEM независимых экспериментов с каждым донором. Для (B, C, E) данные были проанализированы с помощью однофакторного ANOVA с тестом Tukey post hoc.
Далее мы проанализировали, влияет ли BTKi на путь BDCA-2. Активация BDCA-2 снижает производство IFN-α у pDCs после стимуляции различными лигандами TLR (рисунок 2A,B), что соответствует предыдущим наблюдениям [6]. Поскольку индукция IFN‐α R848 не была блокирована BTKi (Рисунок 1E), мы использовали эту систему для анализа роли BTKi в пути BDCA‐2. BTKi устраняли BDCA‐2-зависимую ингибирование производства IFN‐α (Рисунок 2C,D). Интересно, что блокировка сигнализации BDCA‐2 была более чувствительной к BTKi, чем соответствующее ингибирование активации через TLR‐9 в pDCs (Рисунок 2E).BTK‐i отменяет эффект уменьшения интерферона BDCA‐2 в пDCs. (A) pDCs (n = 3) были стимулированы R848 и агонистическим моноклональным антителом к BDCA‐2 или контрольным антителом, и определено количество выделяемого IFN‐α2. (B) pDCs (n = 17) были стимулированы указанными ТЛР-лигандами в присутствии нет антитела (‐), моноклонального антитела к BDCA‐2 (10 µg/mL) или контрольного антитела (10 µg/mL). (C) pDCs были стимулированы R848. Добавлено антитело к BDCA‐2, контрольное антитело, Ибрутиниб (100 нМ) и Фенебрутибин (100 нМ) по указанию. (D) pDCs (n = 13) были обработаны Ибрутинибом (черный) или Фенебрутибибом (пурпурный) в течение 1 ч до стимуляции R848 (10 µg/mL) и добавления антитела к BDCA‐2 (10 µg/mL). Супернатанты собирались после 15 ч и анализировались на IFN‐α2. (E) Значения IC 50 для ингибирования BTKi активацией TLR‐7, TLR‐9 и BDCA‐2. IC 50 определялись с помощью 4-параметрической логистической модели.
Взаимодействие BDCA‐2 было сообщено о том, что оно приводит к образованию сигнального комплекса, похожего на BCR signalosome, и предполагалось, что BTK может участвовать в сигнализации BDCA‐2 [9], хотя экспериментальные данные отсутствовали. Наш эксперимент показал, что BTKi блокирует ингибирование IFN‐α через BDCA‐2. Мы сравнили BTKi Ibrutinib и Fenebrutinib. Хотя Fenebrutinib специфичен для BTK, Ibrutinib также целенаправленно воздействует на другие киназы семьи TEC. Таким образом, наши эксперименты показывают, что BTK — единственный киназа семьи TEC, необходимая для сигнализации BDCA‐2. Далее, прямые механизмы доказательства фосфорилирования BTK при взаимодействии BDCA‐2 и последующей сигнализации, например, через IRF‐7, должны быть подробно изучены.
Наш вывод, что BTKi блокируют путь BDCA‐2, что, в свою очередь, усиливает производство IFN‐α, может способствовать объяснению причины неожиданного неэффективности BTKi в СЛЭ [ 2 ]. Во-первых, IFN‐α обычно считается ключевым фактором в развитии СЛЭ, и в соответствии с этим женщины производят больше IFN‐α в ответ на взаимодействие TLR‐7 (Рисунок 1 и [ 7 ]) и чаще развивают СЛЭ, чем мужчины. Второй, стимуляция BDCA с помощью агонистических антител является перспективной терапией при СЛЭ [10]. В мышиных моделях СЛЭ BTKi оказался успешным, но так как BDCA-2 присутствует только у людей, усиление продукции IFN-α блокировкой пути BDCA-2 с помощью BTKi не могло быть отражено в этих моделях.
В совокупности, наши данные способствуют лучшему пониманию неудачи BTKi при СЛЭ и могут быть релевантны текущим клиническим испытаниям при МС.
Конфликты интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
Пeer Review
История рецензирования для этой статьи доступна по адресу https://publons.com/publon/10.1002/eji.202450985 .Дополнительная информация
Дополнительная информация
Благодарности
Эта работа поддержана DFG (SFB TR128; ID 213904703) и CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)-Stiftung: Call 19/2022 (исследовательская стипендия для VB). Мы благодарим доктора Эдуардо Бельтрана за ценные советы. Мы благодарим Центральную лабораторию флоу-цитометрии в Биомедицинском центре, LMU Мюнхен, за поддержку и докторов Франзиске Талере и Наото Каваками за ценные комментарии по рукописи.
Открытое финансирование организовано и обеспечено Проектом DEAL.Финансирование: исследование было финансировано CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)‐Stiftung: зов 19/2022 (научная стипендия для VB), а также Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR128.
Статус доступности данных
Подробные протоколы и вычислительные аналитические потоки этого исследования, а также данные доступны соответствующему автору по запросу.
Ссылки
Связанные данные
Дополнительные материалы
Поддерживающая информация
Статус доступности данных
Подробные протоколы и вычислительные аналитические потоки этого исследования, а также данные доступны соответствующему автору по запросу.
Брутона киназа тирозина
Ингибиторы Брутона киназы тирозина
интерферон
многочисленная склероз
плазмацидные дендрические клетки
системный лупус эритематозус
Toll-подобный рецептор
Примечания и наблюдения
Брутона киназа тирозина (BTK) является важной частью комплекса сигналов рецептора B-клеток (BCR) и участвует в сигнализации Fc и Toll-подобных рецепторов (TLR) [1]. Хотя роль BTK в активации иммунных клеток хорошо изучена, ее функция в ингибирующих путях остается неясной. Ингибиторы BTK (BTKi) исследуются в различных аутоиммунных заболеваниях с разными результатами. В системной красной волчанке (СКВ) ингибиторы BTK (BTKi) неожиданно не показали эффективность [2], в то время как BTKi перспективны при множественном склерозе (МС) [3]. Эти различия в результатах могут в значительной мере быть обусловлены различными иммунологическими механизмами патогенеза, связанными с различными функциями интерферонов типа 1. Хотя IFN-β является утвержденным лечением при обострениях МС и сигнализация рецептора интерферонов-альфа/бета (IFNAR) на моэлоидных клетках ограничивает аутоиммунные реакции в ЦНС [4], IFN-α способствует патогенезу в СКВ. После активации через TLR-7 и TLR-9 пDCs становятся основными производителями IFN-α и, следовательно, вносят вклад в аутоиммунную инфляцию [5].В данном исследовании мы проанализировали влияние BTKi (Fenebrutinib и Ibrutinib) на производство IFN‐α пDCs через TLR‐7 или TLR‐9, а также на ингибирующий путь BDCA‐2. Связывание и последующая внутренизация BDCA‐2, C‐тип лектина, исключительно выраженного на человеческих пDCs, ингибирует производство интерферона [ 6 ]; однако точное составление сигма-комплекса, медиающего этот процесс, не полностью изучено. Мы наблюдали, что пDCs женщин производили большее количество IFN‐α при лигации TLR‐7 (Рисунок 1A). Это может быть связано с эффектами тестостерона или неполной деактивацией X-связанного гена TLR‐7 [ 7 ]. Активация pDCs через TLR‐9 (используя CpG) и TLR‐7 (используя R848) привела к высвобождению IFN‐α2 (Рисунок 1B; Рисунок S1), отражающему общее производство IFN‐α (Рисунок 1C; Рисунок S1A–C и ссылки). BTKi снизила высвобождение IF:α2 после стимуляции через TLR‐9, но не влияла на стимуляцию через TLR‐7 (Рисунок 1C–E). Какой киназа может заменить BTK в пути TLR7 в pDCs остается неизвестным. В отличие от наблюдаемых эффектов на pDCs, BTKi блокировал активацию B-клеток как через TLR‐7, так и через TLR‐9 (Рисунок S2A–D), что согласуется с предыдущими отчетами [8]. Кроме того, BTKi подавляло дифференцировку плазмабластов, обусловленную TLR, но не влияло на уже дифференцированные плазмабласты (Рис. S2E,F).
BTKi снижает активацию человека pDCs, обусловленную TLR-9, но не TLR-7. (A) Ответ на интерферон у enrichенных pDCs и частота pDCs в зависимости от пола (мужской n = 22; женский n = 13). Индекс ответа на интерферон определялся как описано в дополнении и проверялся с помощью двуххвостового t-теста. (B) Purified pDCs (n = 10) были стимулированы агентами TLR и определена величина высвобождения IFN-α2. (C) Purified pDCs (n = 12) были обработаны Ибрутинибом (черный) или Фенебрутибибом (пурпурный) в течение 1 ч перед стимуляцией CpG-A (2,5 мкг/мл). Значения IC 50 определялись с помощью логистической регрессии с использованием четырёхпараметрической лог-логистической модели. (D, E) pDCs (n = 17) были обработаны BTKi в течение 1 ч до стимуляции (D) CpG-A (2,5 мкг/мл) и (E) R848 (10 мкг/мл). Данные представляют собой среднее значение ± SEM независимых экспериментов с каждым донором. Для (B, C, E) данные были проанализированы с помощью однофакторного ANOVA с тестом Tukey post hoc.
Далее мы проанализировали, влияет ли BTKi на путь BDCA-2. Активация BDCA-2 снижает производство IFN-α у pDCs после стимуляции различными лигандами TLR (рисунок 2A,B), что соответствует предыдущим наблюдениям [6]. Поскольку индукция IFN‐α R848 не была блокирована BTKi (Рисунок 1E), мы использовали эту систему для анализа роли BTKi в пути BDCA‐2. BTKi устраняли BDCA‐2-зависимую ингибирование производства IFN‐α (Рисунок 2C,D). Интересно, что блокировка сигнализации BDCA‐2 была более чувствительной к BTKi, чем соответствующее ингибирование активации через TLR‐9 в pDCs (Рисунок 2E).BTK‐i отменяет эффект уменьшения интерферона BDCA‐2 в пDCs. (A) pDCs (n = 3) были стимулированы R848 и агонистическим моноклональным антителом к BDCA‐2 или контрольным антителом, и определено количество выделяемого IFN‐α2. (B) pDCs (n = 17) были стимулированы указанными ТЛР-лигандами в присутствии нет антитела (‐), моноклонального антитела к BDCA‐2 (10 µg/mL) или контрольного антитела (10 µg/mL). (C) pDCs были стимулированы R848. Добавлено антитело к BDCA‐2, контрольное антитело, Ибрутиниб (100 нМ) и Фенебрутибин (100 нМ) по указанию. (D) pDCs (n = 13) были обработаны Ибрутинибом (черный) или Фенебрутибибом (пурпурный) в течение 1 ч до стимуляции R848 (10 µg/mL) и добавления антитела к BDCA‐2 (10 µg/mL). Супернатанты собирались после 15 ч и анализировались на IFN‐α2. (E) Значения IC 50 для ингибирования BTKi активацией TLR‐7, TLR‐9 и BDCA‐2. IC 50 определялись с помощью 4-параметрической логистической модели.
Взаимодействие BDCA‐2 было сообщено о том, что оно приводит к образованию сигнального комплекса, похожего на BCR signalosome, и предполагалось, что BTK может участвовать в сигнализации BDCA‐2 [9], хотя экспериментальные данные отсутствовали. Наш эксперимент показал, что BTKi блокирует ингибирование IFN‐α через BDCA‐2. Мы сравнили BTKi Ibrutinib и Fenebrutinib. Хотя Fenebrutinib специфичен для BTK, Ibrutinib также целенаправленно воздействует на другие киназы семьи TEC. Таким образом, наши эксперименты показывают, что BTK — единственный киназа семьи TEC, необходимая для сигнализации BDCA‐2. Далее, прямые механизмы доказательства фосфорилирования BTK при взаимодействии BDCA‐2 и последующей сигнализации, например, через IRF‐7, должны быть подробно изучены.
Наш вывод, что BTKi блокируют путь BDCA‐2, что, в свою очередь, усиливает производство IFN‐α, может способствовать объяснению причины неожиданного неэффективности BTKi в СЛЭ [ 2 ]. Во-первых, IFN‐α обычно считается ключевым фактором в развитии СЛЭ, и в соответствии с этим женщины производят больше IFN‐α в ответ на взаимодействие TLR‐7 (Рисунок 1 и [ 7 ]) и чаще развивают СЛЭ, чем мужчины. Второй, стимуляция BDCA с помощью агонистических антител является перспективной терапией при СЛЭ [10]. В мышиных моделях СЛЭ BTKi оказался успешным, но так как BDCA-2 присутствует только у людей, усиление продукции IFN-α блокировкой пути BDCA-2 с помощью BTKi не могло быть отражено в этих моделях.
В совокупности, наши данные способствуют лучшему пониманию неудачи BTKi при СЛЭ и могут быть релевантны текущим клиническим испытаниям при МС.
Конфликты интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
Пeer Review
История рецензирования для этой статьи доступна по адресу https://publons.com/publon/10.1002/eji.202450985 .Дополнительная информация
Дополнительная информация
Благодарности
Эта работа поддержана DFG (SFB TR128; ID 213904703) и CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)-Stiftung: Call 19/2022 (исследовательская стипендия для VB). Мы благодарим доктора Эдуардо Бельтрана за ценные советы. Мы благодарим Центральную лабораторию флоу-цитометрии в Биомедицинском центре, LMU Мюнхен, за поддержку и докторов Франзиске Талере и Наото Каваками за ценные комментарии по рукописи.
Открытое финансирование организовано и обеспечено Проектом DEAL.Финансирование: исследование было финансировано CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)‐Stiftung: зов 19/2022 (научная стипендия для VB), а также Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR128.
Статус доступности данных
Подробные протоколы и вычислительные аналитические потоки этого исследования, а также данные доступны соответствующему автору по запросу.
Ссылки
Связанные данные
Дополнительные материалы
Поддерживающая информация
Статус доступности данных
Подробные протоколы и вычислительные аналитические потоки этого исследования, а также данные доступны соответствующему автору по запросу.
Читать найденный полный текст
This is an open access article under the terms of the http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abbreviations
Bruton's tyrosine kinase
Bruton's tyrosine kinase inhibitors
interferon
multiple sclerosis
plasmacytoid dendritic cells
systemic lupus erythematosus
Toll‐like receptor
Notes and Insights
Bruton's tyrosine kinase (BTK) is an integral component of the B cell receptor (BCR)‐signalosome and participates in Fc‐ and Toll‐like receptor (TLR) signaling [ 1 ]. While a role for BTK is well‐established in the activation of immune cells, BTK's function in inhibitory pathways is unclear. BTK inhibitors (BTKi) are explored in different autoimmune diseases with disparate results. In systemic lupus erythematosus (SLE), BTKi unexpectedly failed [ 2 ], while BTKi is promising in multiple sclerosis (MS) [ 3 ]. These differing results may in part be due to different immunological mechanisms underlying pathogenesis related to distinct roles of type 1 interferons. While IFN‐β is an established therapy in relapsing MS and the interferon‐alpha/beta receptor (IFNAR) signaling on myeloid cells limits autoimmunity in the CNS [ 4 ], IFN‐α drives pathogenesis in SLE. After activation via TLR‐7 and TLR‐9, pDCs become major producers of IFN‐α and thus contribute to autoimmune inflammation [ 5 ].
In this study, we analyzed the effect of BTKi (Fenebrutinib and Ibrutinib) on the IFN‐α production of pDCs via TLR‐7 or TLR‐9, and on the inhibitory BDCA‐2 pathway. Binding and subsequent internalization of BDCA‐2, a C‐type lectin exclusively expressed on human pDCs, inhibits interferon production [ 6 ]; however, the exact composition of the signalosome mediating this cascade is not fully elucidated. We observed that pDCs of females produced more IFN‐α upon TLR‐7‐ligation (Figure 1A ). This might arise from the effects of testosterone or incomplete inactivation of the X‐linked TLR‐7 gene [ 7 ]. Activation of pDCs via TLR‐9 (using CpG) and TLR‐7 (using R848) induced the release of IFN‐α2 (Figure 1B ; Figure S1 ), reflecting the overall IFN‐α production (Figure 1C ; Figure S1A–C and references therein). BTKi reduced the release of IFN‐α2 after stimulation via TLR‐9, but not via TLR‐7 (Figure 1C–E ). Which kinase can substitute for BTK in the TLR7 pathway in pDCs remains to be investigated. In contrast to the observed effects on pDCs, BTKi blocked the activation of B cells by both TLR‐7 and TLR‐9 (Figure S2A–D ), consistent with previous reports [ 8 ]. Furthermore, BTKi abrogated TLR‐driven plasmablast differentiation but did not affect differentiated plasmablasts (Figure S2E,F ).
BTKi reduces TLR‐9‐, but not TLR‐7 mediated activation of human pDCs. (A) IFN‐responsiveness of enriched pDCs and pDC frequencies based on the sex (male n = 22; female n = 13). The interferon response index was determined as described in the supplement and tested using a two‐tailed t ‐test. (B) Purified pDCs ( n = 10) were stimulated with TLR agonists and the release of IFN‐α2 was determined. (C) Purified pDCs ( n = 12) were treated with Ibrutinib (black) or Fenebrutinib (purple) for 1 h prior to stimulation with CpG‐A (2.5 µg/mL). IC 50 values were determined by logistic regression using a four‐parameter log‐logistic model. (D, E) pDCs ( n = 17) were treated with the BTKi for 1 h prior to stimulation with (D) CpG‐A (2.5 µg/mL) and (E) R848 (10 µg/mL). Data represent the mean ± SEM of independent experiments with each donor. For (B, C, E) data were analyzed by one‐way ANOVA with Tukey's post hoc tests.
Next, we analyzed whether BTKi affects the BDCA‐2 pathway. Engagement of BDCA‐2 reduced IFN‐α production by pDCs after stimulation with different TLR ligands (Figure 2A,B ), extending previous observations [ 6 ]. Since the induction of IFN‐α by R848 was not blocked by BTKi (Figure 1E ), we used this system to analyze the role of BTKi in the BDCA‐2 pathway. BTKi abrogated the BDCA‐2‐mediated inhibition of IFN‐α production (Figure 2C,D ). Intriguingly, the blocking of BDCA‐2 signaling was more sensitive to BTKi than the corresponding inhibition of activation via TLR‐9 in pDCs (Figure 2E ).
BTK‐i abrogates the IFN‐attenuating effect of BDCA‐2 in pDCs. (A) pDCs ( n = 3) were stimulated with R848 and an agonistic mAb to BDCA‐2 or isotype control Ab and the secreted IFN‐α2 was determined. (B) pDCs ( n = 17) were stimulated with the indicated TLR ligands in the presence of no Ab (‐), the mAb to BDCA‐2 (10 µg/mL), or a control mAb (10 µg/mL). (C) pDCs were stimulated with R848. An anti‐BDCA‐2 mAb, a control mAb, Ibrutinib (100 nM), and Fenebrutinib (100 nM) were added as indicated. (D) pDCs ( n = 13) were treated with Ibrutinib (black) or Fenebrutinib (purple) for 1 h prior to stimulation with R848 (10 µg/mL) and the addition of anti‐BDCA‐2 mAb (10 µg/mL). Supernatants were collected after 15 h and analyzed for IFN‐α2. (E) IC 50 values for BTKi inhibiting TLR‐7, TLR‐9, and BDCA‐2 mediated activation. IC 50 were determined by 4‐parameter‐logistic modeling.
BDCA‐2 engagement has been reported to induce the formation of a signaling complex resembling the BCR signalosome and it was proposed that BTK may participate in BDCA‐2 signaling [ 9 ], although experimental evidence was lacking. Our experiments established that BTKi blocks the inhibition of IFN‐α via BDCA‐2. We compared the BTKi Ibrutinib and Fenebrutinib throughout. While Fenebrutinib is specific for BTK, Ibrutinib also targets other TEC family kinases. Thus, our experiments indicate that BTK is the only TEC family kinase required for BDCA‐2 signaling. Further direct mechanistic evidence of BTK phosphorylation upon BDCA‐2 engagement and downstream signaling, for example, via IRF‐7 should be elaborated.
Our finding that BTKi block the BDCA‐2 pathway thereby enhancing IFN‐α production might contribute to the explanation of why BTKi failed unexpectedly in SLE [ 2 ]. First, IFN‐α is commonly regarded to drive SLE, and in line with this, females produce more IFN‐α in response to TLR‐7 engagement (Figure 1 and [ 7 ]) and develop SLE far more frequently than men. Second, stimulating BDCA by agonistic antibodies is a promising therapy in SLE [ 10 ]. In mouse models of SLE, BTKi was successful, but as BDCA‐2 is exclusively found in humans, the enhancement of IFN‐α production by blocking the BDCA‐2 pathway with BTKi could not be mirrored in those models.
Collectively, our findings contribute to further understanding the failure of BTKi in SLE and might be of relevance for ongoing clinical trials in MS.
Conflicts of Interest
The authors declare no conflicts of interest.
Peer Review
The peer review history for this article is available at https://publons.com/publon/10.1002/eji.202450985 .
Supporting information
Supporting Information
Acknowledgments
This work was supported by the DFG (SFB TR128; ID 213904703) and by the CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)‐Stiftung: Call 19/2022 (research fellowship to VB). We thank Dr. Eduardo Beltran for valuable support. We are grateful to the Core Facility Flow Cytometry at the Biomedical Center, LMU Munich for support and to Drs. Franziska Thaler and Naoto Kawakami for valuable comments on the manuscript.
Open access funding enabled and organized by Projekt DEAL.
Funding : The research was funded by the CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)‐Stiftung: Call 19/2022 (research fellowship to VB), and the Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR128.
Data Availability Statement
Detailed protocols and computational analysis pipelines of this study as well as data are available from the corresponding author upon request.
References
Associated Data
Supplementary Materials
Supporting Information
Data Availability Statement
Detailed protocols and computational analysis pipelines of this study as well as data are available from the corresponding author upon request.
Bruton's tyrosine kinase
Bruton's tyrosine kinase inhibitors
interferon
multiple sclerosis
plasmacytoid dendritic cells
systemic lupus erythematosus
Toll‐like receptor
Notes and Insights
Bruton's tyrosine kinase (BTK) is an integral component of the B cell receptor (BCR)‐signalosome and participates in Fc‐ and Toll‐like receptor (TLR) signaling [ 1 ]. While a role for BTK is well‐established in the activation of immune cells, BTK's function in inhibitory pathways is unclear. BTK inhibitors (BTKi) are explored in different autoimmune diseases with disparate results. In systemic lupus erythematosus (SLE), BTKi unexpectedly failed [ 2 ], while BTKi is promising in multiple sclerosis (MS) [ 3 ]. These differing results may in part be due to different immunological mechanisms underlying pathogenesis related to distinct roles of type 1 interferons. While IFN‐β is an established therapy in relapsing MS and the interferon‐alpha/beta receptor (IFNAR) signaling on myeloid cells limits autoimmunity in the CNS [ 4 ], IFN‐α drives pathogenesis in SLE. After activation via TLR‐7 and TLR‐9, pDCs become major producers of IFN‐α and thus contribute to autoimmune inflammation [ 5 ].
In this study, we analyzed the effect of BTKi (Fenebrutinib and Ibrutinib) on the IFN‐α production of pDCs via TLR‐7 or TLR‐9, and on the inhibitory BDCA‐2 pathway. Binding and subsequent internalization of BDCA‐2, a C‐type lectin exclusively expressed on human pDCs, inhibits interferon production [ 6 ]; however, the exact composition of the signalosome mediating this cascade is not fully elucidated. We observed that pDCs of females produced more IFN‐α upon TLR‐7‐ligation (Figure 1A ). This might arise from the effects of testosterone or incomplete inactivation of the X‐linked TLR‐7 gene [ 7 ]. Activation of pDCs via TLR‐9 (using CpG) and TLR‐7 (using R848) induced the release of IFN‐α2 (Figure 1B ; Figure S1 ), reflecting the overall IFN‐α production (Figure 1C ; Figure S1A–C and references therein). BTKi reduced the release of IFN‐α2 after stimulation via TLR‐9, but not via TLR‐7 (Figure 1C–E ). Which kinase can substitute for BTK in the TLR7 pathway in pDCs remains to be investigated. In contrast to the observed effects on pDCs, BTKi blocked the activation of B cells by both TLR‐7 and TLR‐9 (Figure S2A–D ), consistent with previous reports [ 8 ]. Furthermore, BTKi abrogated TLR‐driven plasmablast differentiation but did not affect differentiated plasmablasts (Figure S2E,F ).
BTKi reduces TLR‐9‐, but not TLR‐7 mediated activation of human pDCs. (A) IFN‐responsiveness of enriched pDCs and pDC frequencies based on the sex (male n = 22; female n = 13). The interferon response index was determined as described in the supplement and tested using a two‐tailed t ‐test. (B) Purified pDCs ( n = 10) were stimulated with TLR agonists and the release of IFN‐α2 was determined. (C) Purified pDCs ( n = 12) were treated with Ibrutinib (black) or Fenebrutinib (purple) for 1 h prior to stimulation with CpG‐A (2.5 µg/mL). IC 50 values were determined by logistic regression using a four‐parameter log‐logistic model. (D, E) pDCs ( n = 17) were treated with the BTKi for 1 h prior to stimulation with (D) CpG‐A (2.5 µg/mL) and (E) R848 (10 µg/mL). Data represent the mean ± SEM of independent experiments with each donor. For (B, C, E) data were analyzed by one‐way ANOVA with Tukey's post hoc tests.
Next, we analyzed whether BTKi affects the BDCA‐2 pathway. Engagement of BDCA‐2 reduced IFN‐α production by pDCs after stimulation with different TLR ligands (Figure 2A,B ), extending previous observations [ 6 ]. Since the induction of IFN‐α by R848 was not blocked by BTKi (Figure 1E ), we used this system to analyze the role of BTKi in the BDCA‐2 pathway. BTKi abrogated the BDCA‐2‐mediated inhibition of IFN‐α production (Figure 2C,D ). Intriguingly, the blocking of BDCA‐2 signaling was more sensitive to BTKi than the corresponding inhibition of activation via TLR‐9 in pDCs (Figure 2E ).
BTK‐i abrogates the IFN‐attenuating effect of BDCA‐2 in pDCs. (A) pDCs ( n = 3) were stimulated with R848 and an agonistic mAb to BDCA‐2 or isotype control Ab and the secreted IFN‐α2 was determined. (B) pDCs ( n = 17) were stimulated with the indicated TLR ligands in the presence of no Ab (‐), the mAb to BDCA‐2 (10 µg/mL), or a control mAb (10 µg/mL). (C) pDCs were stimulated with R848. An anti‐BDCA‐2 mAb, a control mAb, Ibrutinib (100 nM), and Fenebrutinib (100 nM) were added as indicated. (D) pDCs ( n = 13) were treated with Ibrutinib (black) or Fenebrutinib (purple) for 1 h prior to stimulation with R848 (10 µg/mL) and the addition of anti‐BDCA‐2 mAb (10 µg/mL). Supernatants were collected after 15 h and analyzed for IFN‐α2. (E) IC 50 values for BTKi inhibiting TLR‐7, TLR‐9, and BDCA‐2 mediated activation. IC 50 were determined by 4‐parameter‐logistic modeling.
BDCA‐2 engagement has been reported to induce the formation of a signaling complex resembling the BCR signalosome and it was proposed that BTK may participate in BDCA‐2 signaling [ 9 ], although experimental evidence was lacking. Our experiments established that BTKi blocks the inhibition of IFN‐α via BDCA‐2. We compared the BTKi Ibrutinib and Fenebrutinib throughout. While Fenebrutinib is specific for BTK, Ibrutinib also targets other TEC family kinases. Thus, our experiments indicate that BTK is the only TEC family kinase required for BDCA‐2 signaling. Further direct mechanistic evidence of BTK phosphorylation upon BDCA‐2 engagement and downstream signaling, for example, via IRF‐7 should be elaborated.
Our finding that BTKi block the BDCA‐2 pathway thereby enhancing IFN‐α production might contribute to the explanation of why BTKi failed unexpectedly in SLE [ 2 ]. First, IFN‐α is commonly regarded to drive SLE, and in line with this, females produce more IFN‐α in response to TLR‐7 engagement (Figure 1 and [ 7 ]) and develop SLE far more frequently than men. Second, stimulating BDCA by agonistic antibodies is a promising therapy in SLE [ 10 ]. In mouse models of SLE, BTKi was successful, but as BDCA‐2 is exclusively found in humans, the enhancement of IFN‐α production by blocking the BDCA‐2 pathway with BTKi could not be mirrored in those models.
Collectively, our findings contribute to further understanding the failure of BTKi in SLE and might be of relevance for ongoing clinical trials in MS.
Conflicts of Interest
The authors declare no conflicts of interest.
Peer Review
The peer review history for this article is available at https://publons.com/publon/10.1002/eji.202450985 .
Supporting information
Supporting Information
Acknowledgments
This work was supported by the DFG (SFB TR128; ID 213904703) and by the CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)‐Stiftung: Call 19/2022 (research fellowship to VB). We thank Dr. Eduardo Beltran for valuable support. We are grateful to the Core Facility Flow Cytometry at the Biomedical Center, LMU Munich for support and to Drs. Franziska Thaler and Naoto Kawakami for valuable comments on the manuscript.
Open access funding enabled and organized by Projekt DEAL.
Funding : The research was funded by the CAPES/Alexander von Humboldt (AvH)‐Stiftung: Call 19/2022 (research fellowship to VB), and the Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR128.
Data Availability Statement
Detailed protocols and computational analysis pipelines of this study as well as data are available from the corresponding author upon request.
References
Associated Data
Supplementary Materials
Supporting Information
Data Availability Statement
Detailed protocols and computational analysis pipelines of this study as well as data are available from the corresponding author upon request.