MedElevator
Войти в исследования DOI 10.1038/s41598-022-12851-9
Оптимизация анализа насыщенности БРЕТ для надежных и чувствительных исследований взаимодействия цитосолика и протеина.
Аннотация
Насыщение биолюминесцентным резонансом передачи энергии (BRET) является методом изучения взаимодействия белка и протеина (PPI) при количественной оценке зависимости сигнала BRET от отношения к выражению приемщика/донора (A:D). В этом исследовании, используя очень яркую пару Nluc/YPF BRET, приобретенную соответственно с помощью микрозвукового считывателя и автоматизированной конфокальной микроскопии, мы значительно улучшили анализ насыщенности BRET путем расширения диапазона обнаружения выражения A:D и нормализации выражения A:D с помощью нового зонда, свободного от BRET. Далее мы обнаружили, что при использовании переменной, а не фиксированного количества молекул-доноров, которые выражаются в возрастающих концентрациях абитуриента, при изучении цитосоличного белка можно еще больше повысить надежность насыщения БРЕТ, хотя относительное количество димеров (BRETmax) и относительная амплитуда димера (BRET50) остаются такими же. В целом мы показываем, что наш метод может быть применен ко многим сетям ИЦП, включая маршрут NF-IB, наноорган высокого уровня, взаимодействие вируса-призрака бешенства, комплекс MTR и сигнализацию JAK/STAT. В целом наш подход открывает путь для надежного подтверждения и определения ИЦП в живых клетках.
Название и аннотация на языке оригинала
Optimization of BRET saturation assays for robust and sensitive cytosolic protein-protein interaction studies.
Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) saturation is a method of studying protein-protein interaction (PPI) upon quantification of the dependence of the BRET signal on the acceptor/donor (A:D) expression ratio. In this study, using the very bright Nluc/YFP BRET pair acquired respectively with microplate reader and automated confocal microscopy, we significantly improved BRET saturation assay by extending A:D expression detection range and normalizing A:D expression with a new BRET-free probe. We next found that upon using variable instead of fixed amount of donor molecules co-expressed with increasing acceptor concentrations, BRET saturation assay robustness can be further improved when studying cytosolic protein, although the relative amounts of dimers (BRETmax) and the relative dimer affinity (BRET50) remain similar. Altogether, we show that our method can be applied to many PPI networks, involving the NF-κB pathway, high-affinity nanobody, rabies virus-host interactions, mTOR complex and JAK/STAT signaling. Altogether our approach paves the way for robust PPI validation and characterization in living cells.
Предметные рубрики MeSH
Подготовка и перевод публикации
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Тип публикации указан по данным источника. Уровень доказательности автоматически не присваивается.