MedElevator
Войти в исследования Обработка и подклеточная локализация вируса гепатита Е: идентификация потенциальных вирусных заводов.
Аннотация
Вирус гепатита Е (ГЭМ) является основной причиной острого гепатита во всем мире. ГЭМ — положительный вирус РНК, выражающий три открытых считывания (ОРФ). ОРФ1 кодирует неструктурный полипротеин ОРФ1, вирусный репликатор, который транскриптирует геном полной длины, и субгеномный РНК, кодирующий белки структуры ОРФ2 и ОРФ3. В настоящем исследовании основное внимание уделяется этапу тиражирования с целью определения того, обрабатывается ли полипротеин ОРФ1 в течение жизненного цикла ГЭМ, и определения того, где репликация происходит внутри ячейки, в которой находится хостинг. Поскольку ни один коммерческий антитела не распознает ОРФ1 в клетках, повторяющих ГЭМ, мы стремились ввести эпитопические метки в белок ОРФ1 без воздействия на эффективность репликации вируса. Таким образом, были выбраны два места ввода, расположенные в гиперварианте, чтобы выдержать эпитопе V5 при сохранении эффективности воспроизведения ГЭМ. После интеграции в инфекционный полный штамм Керноу C-1 p6, эпитопы V5 не повлияли ни на воспроизведение геномики, ни на производство субгеномической РНК. Кроме того, покрытые V5 вирусные частицы оставались такими же инфекционными, как и частицы диких типов в клетках Huh-7.5. Далее, модель выражения V5-тэгированного ORF1 сравнивалась с гетерологичным выражением и репликативными системами ГЭМ. Протеин с высоким молекулярным весом (180 кДa), который был выражен во всех трех системах и который, вероятно, соответствует необработанной форме ORF1, был обнаружен в течение 25 дней после электропорации в системе клеточной культуры p6. Кроме того, в цитоплазмических и ядерных средах было обнаружено меньшее количество продуктов с более низким молекулярным весом. Одновременно с этим ОРФ1 с V5-тэгированный был локализован с помощью конфокальной микроскопии внутри ядра клеток, а также как компактные периядерно-подструктуры, в которых были обнаружены белки ОРФ2 и ОРФ3. Важно отметить, что с использованием гибридизации in situ (RNA Contribution __), позитивные и негативные ГЭМ-RNA были локализованы в периядерной субструктуре клеток, производящих ГЭМ. Наконец, одновременно с обнаружением ГЭМ геномных РНК и вирусных белков в этих подструктурах, мы определили потенциальные заводы ГЭМ.
Название и аннотация на языке оригинала
Processing and Subcellular Localization of the Hepatitis E Virus Replicase: Identification of Candidate Viral Factories.
Hepatitis E virus (HEV) is the major cause of acute hepatitis worldwide. HEV is a positive-sense RNA virus expressing three open reading frames (ORFs). ORF1 encodes the ORF1 non-structural polyprotein, the viral replicase which transcribes the full-length genome and a subgenomic RNA that encodes the structural ORF2 and ORF3 proteins. The present study is focused on the replication step with the aim to determine whether the ORF1 polyprotein is processed during the HEV lifecycle and to identify where the replication takes place inside the host cell. As no commercial antibody recognizes ORF1 in HEV-replicating cells, we aimed at inserting epitope tags within the ORF1 protein without impacting the virus replication efficacy. Two insertion sites located in the hypervariable region were thus selected to tolerate the V5 epitope while preserving HEV replication efficacy. Once integrated into the infectious full-length Kernow C-1 p6 strain, the V5 epitopes did neither impact the replication of genomic nor the production of subgenomic RNA. Also, the V5-tagged viral particles remained as infectious as the wildtype particles to Huh-7.5 cells. Next, the expression pattern of the V5-tagged ORF1 was compared in heterologous expression and replicative HEV systems. A high molecular weight protein (180 kDa) that was expressed in all three systems and that likely corresponds to the unprocessed form of ORF1 was detected up to 25 days after electroporation in the p6 cell culture system. Additionally, less abundant products of lower molecular weights were detected in both in cytoplasmic and nuclear compartments. Concurrently, the V5-tagged ORF1 was localized by confocal microscopy inside the cell nucleus but also as compact perinuclear substructures in which ORF2 and ORF3 proteins were detected. Importantly, using in situ hybridization (RNAScope ®), positive and negative-strand HEV RNAs were localized in the perinuclear substructures of HEV-producing cells. Finally, by simultaneous detection of HEV genomic RNAs and viral proteins in these substructures, we identified candidate HEV factories.
Подготовка и перевод публикации
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Тип публикации указан по данным источника. Уровень доказательности автоматически не присваивается.