Аденофекция: Метод изучения роли молекулярных каперонов в клеточной морфодинамике с помощью экспериментов по разрушению и спасению.

Клеточные процессы, такие как митоз и дифференциация клеток, регулируются изменениями формы клеток, которые в значительной степени зависят от надлежащей модификации структур цитоскелета клеток. Это включает сборку макромолекулярных структур более высокого порядка в определенное время и в определенном месте, процесс, который особенно чувствителен к возмущениям, вызываемым чрезмерным выражением белков. Методы, способные сохранить гомеостаз протеина и поддерживать почти нормальную клеточную морфологию, крайне желательны для определения функционального вклада белка, представляющего интерес, в широкий спектр клеточных процессов. Трансцентральные эксперименты по спасению от истощения, основанные на вмешательстве РНК, являются мощными подходами к анализу белковых функций и структурных требований. Однако восстановление целевого белока с минимальным отклонением от его физиологического уровня является реальной проблемой. Здесь мы описываем метод, называемый аденофакцией, который был разработан для изучения роли молекулярных сопровождающих и партнеров в нормальном функционировании разделительных клеток и связи с реконструкцией актина. Клетки Hela были истощены из BAG3 с сирна дюплексами, направленными на район 3'UTR. Протеины BAG3 были одновременно вновь включены в >75% клеток с использованием рекомбинантных аденовирозов, соединенных с реагентами трансфекционного действия. Аденофекция позволила выразить белки BAG3-GPF на уровне, близком к физиологическому уровню в клетках HeLa, истощенных BAG3, при отсутствии реакции на стресс. Никакого воздействия на уровень эндогенных тепловых шоковых протеинов - главных индукционных регуляторов гомеостаза белков - не наблюдалось. Кроме того, добавляя бакуловирусы, приводящие к выражению флуоресцентных маркеров во время трансдукции клеток-трансфекции, мы могли бы дистактировать митотическая динамику клеток путем проведения микроскопического анализа по времени с минимальными помехами нормального митотического развития. Аденофекция применима также к трудно заражённым клеткам мыши и пригодна для функционального анализа миобразовой дифференциации в миотубы. Таким образом, аденофекция представляет собой разносторонний метод для проведения структурно-функционального анализа белков, вовлеченных в чувствительные биологические процессы, которые зависят от динамики цитоскелета более высокого порядка.