Transcriptional fusions to the lacZ gene from Escherichia coli can be used to study gene expression. Here, we describe protocols for using a miniTn5 derivative to generate random insertions of the lacZY operon in the genome of Salmonella enterica serovar Typhimurium, to analyze the expression of transcriptional lac fusions under different conditions, and to identify the genomic location of some fusions.
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Analyses of virulence functions of Salmonella enterica demand generation of plasmids for complementation of mutated genes, expression of tagged alleles of effector proteins of the type III secretion systems, or fusions to reporter genes for investigation of regulation of expression, or protein localization and fate after translocation into host cells. Here, a simple and versatile approach for generation of plasmids from modular DNA fragments is described. The Modular Cloning approach is based on Gibson assembly and uses standardized overlap sequences that enable various combinations and reuse
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
The 3'→5' RNA helicase YTHDC2 is a posttranscriptional regulator of gene expression in reproductive cells, where it is essential for the progression of meiosis. But a detailed understanding of its molecular mechanism is currently lacking. Cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) followed by high-throughput sequencing is a well-established method for transcriptome-wide identification of the positions of protein-RNA interactions and has played a critical role in studies of RNA-binding proteins. In this chapter, we present an optimized protocol for performing YTHDC2 CLIP in mouse testes to id
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Stress granules (SGs) are cytoplasmic, membrane-less ribonucleoprotein (RNP) granules that form in response to cellular stress following the inhibition of translation initiation. Their assembly, composition, and crosstalk with processing bodies (P-bodies) are mediated by protein-protein, RNA-protein, and RNA-RNA interactions. DEAD/DEAH-box RNA helicases are key regulators of stress granules. Here, we present standardized protocols for (i) immunofluorescence of stress granule and P-body scaffold proteins and helicases, (ii) single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smRNA FISH), an
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Biochemical testing plays a crucial role in the detection and confirmation of Salmonella spp. Since the cultural characteristics of Salmonella often resemble those of other enteric pathogens, differentiation based solely on growth features can be challenging. Biochemical tests allow for accurate identification by exploiting the distinct metabolic traits of Salmonella. In this study, we described three key tests, including methyl red, hydrogen sulfide production, and urease production, which are particularly important for the confirmation of Salmonella.
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Salmonella is an important zoonotic pathogen that is widely distributed in livestock, poultry, and other animals. Salmonella contamination not only affects the healthy development of the livestock industry but also poses a serious threat to public health. Therefore, establishing detection methods capable of simultaneously identifying different Salmonella serotypes is crucial. Among current detection methods for Salmonella, immunological detection methods using MAbs offer high throughput, shorter processing times, and enhanced specificity, making them useful for rapid Salmonella detection. The
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
A rapid and simple electrochemical immunosensor enables the detection of Salmonella in milk. Bacteria are captured and concentrated from samples by antibody-coated magnetic beads and simultaneously labeled with a horseradish peroxidase (HRP) conjugate. The complexes are captured onto an electrode to achieve, upon the addition of HRP substrate, an amperometric signal proportional to the bacterial load. The method detects about 104 CFU mL-1 in diluted milk within 50 min without enrichment. After an 8-h pre-enrichment step, the sensitivity improves to below 1 CFU mL-1, equivalent to ~1-3 CFU in 2
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
DEAD-box helicases DDX5 and DDX17 play a key role in regulating gene expression and RNA processing in mammalian cells. In particular, they are involved in alternative splicing and in the 3' end processing of nascent transcripts associated with the termination of transcription. In this chapter, we present experimental protocols and computational tools that altogether enable the prediction and validation of various types of changes in the neuroblastoma cell transcriptome upon the depletion of both helicases. This includes protocols for monitoring variations in alternative splicing, readthrough t
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Conventional analysis of RNA products synthesized by bacterial RNA polymerase (RNAP) in in vitro transcription assays relies on radioactive labeling, followed by separation of labeled RNAs by denaturing urea-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). This approach provides excellent resolution across a wide range of RNA lengths (from 2 nt to several hundred nucleotides), but the use of radioisotopes requires specialized facilities, strict waste-disposal procedures, and is often restricted. To circumvent these limitations, we adapted a standard in vitro transcription assay for use with the Agil
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Helicases are versatile enzymes. Superfamily 2 (SF2) is the largest and most diverse group of helicases. SF2 helicases are involved in fundamental processes dealing with nucleic acids in the three domains of life and can be specific to DNA, RNA, or DNA:RNA hybrids. They are known to catalyze unwinding reactions in vitro or disrupt duplexes in vivo. More recently, it has emerged that they can also anneal single strands to form duplexes. Here, we describe biochemical assays used to investigate the activities of the Ski2-like helicases ASH-Ski2 and Hel308, as well as the Lhr-like helicase Lhr2 fr
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
DEAD-box RNA helicases (DDXs) are a family of enzymes that participate in nearly all aspects of cellular RNA metabolism by remodeling RNA structures. Among them, DDX3X plays key roles in diverse physiological processes, including the translational regulation of gene expression, and its malfunction is frequently associated with the onset of disease. To elucidate the molecular mechanisms of DDX3X, solution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy provides unique insights into its RNA-binding properties, dynamic behavior, and intermolecular interactions, complementing conventional structural
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially gamma-linolenic acid (GLA), arachidonic acid (AA), eicosapentaenoic acid (EPA), and docosahexaenoic acid (DHA), can block HMG-CoA reductase activity and thus decrease cholesterol synthesis/formation. Cholesterol has antioxidant actions and thus reduces the formation of ROS (reactive oxygen species). In contrast, PUFAs augment the generation of ROS. PUFAs undergo peroxidation to form lipid peroxides that are toxic to tumor cells but not normal cells. GPX4 (glutathione peroxidase) reduces the formation of lipid peroxides and thus enhances tumor cel
СтатьяОбзорПоиск полного текста в очередиПеревод пока не подготовлен
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Molecular cloning by PCR amplification using a highly processive, high-fidelity DNA polymerase represents a robust and versatile technique for the precise manipulation of nucleic acid sequences. This approach enables the insertion, replacement, or modification of specific DNA fragments within a cloning vector, thereby generating an accurate copy of a gene or viral segment for downstream applications, such as protein expression, site-directed mutagenesis, and structural or functional analyses. The use of processive, high-fidelity polymerases significantly reduces the occurrence of base substitu
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
The nonstructural protein 2 (nsP2) of chikungunya virus (CHIKV) is an essential cysteine protease involved in viral polyprotein processing and replication complex regulation. Biochemical and structural studies of nsP2 require the availability of highly pure and enzymatically active protein. In this chapter, we describe a straightforward protocol for the heterologous expression and purification of CHIKV nsP2 protease domain (nsP2pro) in Escherichia coli. The protein is expressed at low temperature as a His-tagged construct and purified under native conditions by immobilized metal ion affinity c
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
In this protocol, we describe a PAGE-based assay to evaluate the steady-state kinetics of the nsP2 protease. Using a recombinant GFP-TRX fusion substrate containing the nsP3/4 cleavage site, proteolytic activity is monitored through the appearance of cleavage products resolved by SDS-PAGE. Detection is achieved by Coomassie blue staining or GFP fluorescence emission, followed by densitometric analysis to quantify product formation and calculate initial reaction rates. The protocol provides a robust and accessible method for comparing enzyme activity under varying conditions, and is suitable fo
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Chikungunya virus, a mosquito-borne alphavirus, poses a significant global health threat due to its rapid spread and lack of approved antiviral therapies. The viral nonstructural protein 2 protease (nsP2p) plays a critical role in processing the viral polyprotein to produce key viral enzymes, making it an attractive target for drug development. In this study, we describe the expression and purification of recombinant CHIKV nsP2 protease and establish a robust fluorogenic assay to measure its enzymatic activity using the acc-CHIK15-dnp peptide substrate. The assay enables real-time monitoring o
СтатьяПоддержка NIH: внешняя программаПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Epigenetic regulation provides a dynamic and reversible layer of gene control that functions independently of changes in DNA sequence, primarily mediated by DNA methylation, histone modifications, and higher-order chromatin organization. Aberrant epigenetic states contribute to a wide range of human diseases. However, conventional epigenetic therapies based on small-molecule inhibitors lack locus specificity and often cause global chromatin disturbances. The emergence of programmable epigenetic editing technologies has transformed the field by enabling targeted rewriting of chromatin states at
СтатьяОбзорПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Cell-penetrating peptides (CPPs) provide a modular nonviral strategy for intracellular delivery of CRISPR/Cas9 components, particularly preassembled Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. This chapter summarizes key principles of CPP-mediated Cas9 RNP delivery, including noncovalent complexation and covalent CPP-Cas9 conjugation strategies. A representative protocol is provided for the preparation and evaluation of Cas9-K5 RNP, including in vitro uptake and reporter-editing assays, nucleofection-based functional controls, local intracranial delivery, immunofluorescence staining, and quantitat
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Cas9-guide RNA ribonucleoprotein (RNP) complexes are widely used for genome editing because they provide rapid, transient nuclease activity without introducing exogenous DNA into target cells. Efficient RNP delivery requires a highly purified, correctly folded Cas9 protein that is free of contaminating nucleases and small-molecule impurities. This chapter describes the expression of N-terminally His-tagged Cas9 from a pET28b vector in Escherichia coli Rosetta strains, followed by purification using Ni-NTA immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and size exclusion chromatography (SEC)
СтатьяПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
Lipases, enzymes with widespread presence in nature, have been known since the early nineteenth century when they were initially discovered in bacteria. The ongoing exploration of their characteristics has fueled a growing body of research. This chapter provides a comprehensive overview of the primary origins, structural attributes, and diverse industrial uses of these extensively examined enzymes.
СтатьяОбзорПоиск полного текста в очередиПеревод в очереди
Обработка статьи · этапы, ошибки и управление
Загрузка состояния…
Ошибки и ограничения
История · было → стало
Состояние обновляется каждые 5 секунд, пока блок открыт. Процент показывается только там, где известен объём работы. Пауза останавливает продолжение этапа; текущий запрос к источнику может завершиться.
MedElevator
Войти в исследования